INTRODUCCIÓN
El suelo es un cuerpo dinámico natural y complejo que ocupa gran parte de la superficie terrestre; se encuentra compuesto principalmente por materia orgánica, minerales y organismos, y sirve de sustrato para el crecimiento de las plantas. Las características del suelo varían constantemente en función del clima, el material parental, la topografía, los organismos vivos y el manejo que se le dé en los cultivos.
Dado que el suelo es la base de la vida vegetal y animal, es importante estudiar la presencia en el suelo de agentes químicos exógenos tales como fertilizantes, plaguicidas, coadyuvantes, entre otros (1, 2). La presencia de plaguicidas en el suelo se puede dar por distintas causas teniendo en cuenta que este recibe la mayor parte de los plaguicidas que se emplean en la protección de cultivos, llegando a él por distintas vías como tratamientos directos, tratamientos aéreos o por residuos vegetales presentes después de la cosecha. Debido a lo anterior surge la necesidad de desarrollar e implementar metodologías confiables, rápidas y de bajo impacto ambiental para el análisis de residuos de plaguicidas presentes en el suelo (1).
Dado que el suelo es una matriz compleja y variable, una de las etapas de mayor relevancia en el proceso de análisis de residuos de plaguicidas es el tipo de extracción empleado, ya que esta es una de las etapas que más influye sobre los resultados obtenidos, toda vez que recibe el efecto de las características propias del suelo, tales como contenido de materia orgánica, textura, humedad y pH, y otros factores independientes del suelo, como el tiempo transcurrido desde la aplicación y las propiedades intrínsecas del plaguicida (1, 3-5).
Actualmente, para efectos del análisis de plaguicidas en suelos, existe una gran variedad de métodos de extracción que incluyen tanto el uso de solventes como el empleo de técnicas novedosas, como la microextracción en fase sólida. Cada uno de estos procedimientos tiene ventajas y desventajas, varias de ellas relacionadas con costos, rapidez, selectividad e impacto ambiental, etc. (6-9).
La extracción con fluidos supercríticos (EFS) comenzó a emplearse en la década de 1980, con el propósito de analizar residuos de plaguicidas presentes en suelos, aprovechando algunas de las propiedades que presentan estos fluidos, tales como poder de solvatación, alta difusividad, baja viscosidad y tensión superficial nula (10). En este sentido, el dióxido de carbono supercrítico (CO2 SC) es uno de los solventes más usados en la EFS debido a que posee características consideradas ideales: baja toxicidad, baja inflamabilidad, condiciones críticas bajas (7,38 MPay 31 °C), entre otras (8, 11, 12); sin embargo, el uso de CO2 SC puro en la extracción de residuos de plaguicidas es limitado debido a su baja polaridad. No obstante, distintos investigadores (5, 13-15) han evaluado el efecto de la adición de pequeñas cantidades de solventes orgánicos, empleados como modificadores, en la extracción de numerosos compuestos presentes en diferentes matrices. En este trabajo se evaluó la eficiencia de tres cosolventes, acetato de etilo (AcOEt), acetona (Me2CO) y metanol (MeOH) en la extracción de plaguicidas en suelo empleando CO2 SC.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestra y preparación de suelo blanco
La muestra de suelo blanco, libre de plaguicidas, se tomó del horizonte superficial a una profundidad de 0-20 cm, en las inmediaciones de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, el cual no tiene historia de aplicación de plaguicidas, se secó a temperatura ambiente, se eliminaron ramas, hojas y piedras y se tamizó por una malla No. 10 (2 mm U.S. Standard Sieve Series). El suelo fue caracterizado como un suelo franco arcilloso (20,88% arena, 46,88% arcilla y 32,24% limo) con un bajo contenido de materia orgánica (3,24%), con una humedad de 4,04% y un pH en suelo saturado de 5,29.
Materiales de referencia, reactivos y soluciones
Los estándares de plaguicidas empleados en este trabajo se obtuvieron del Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Alemania), cada uno con una pureza mayor al 95%. Las disoluciones madre se prepararon a una concentración aproximada a 500 µg/mL en acetato de etilo y se almacenaron en frascos ámbar a -20°C. La mezcla de plaguicidas se preparó en acetato de etilo, tomando diferentes volúmenes de cada una de las soluciones madre hasta obtener un rango de concentraciones entre 1,6 µg/mL y 98,3 µg/mL. La mezcla se almacenó en frasco ámbar a -20 °C. Los solventes empleados en este estudio fueron acetato de etilo, acetona (grado análisis de residuos) y metanol (grado HPLC) proporcionados por J. T. Baker®(México D.F., México) Los gases empleados en la extracción y en la determinación cromatográfica fueron CO2 anaerobio, nitrógeno (N2) grado 5,0, hidrógeno (H2) grado 4,5 y aire sintético seco; estos fueron proporcionados por Criogas Colombia (Grupo Indura).
Instrumentos, equipos y procedimientos
Obtención de extractos
Las extracciones se llevaron a cabo en un equipo de extracción supercrítica diseñado y ensamblado en el Laboratorio de Alta Presión del Departamento de Quími
ca de la Universidad Nacional de Colombia (Figura 1). Este equipo se encuentra configurado con reservorio de CO2, una bomba neumática (Haskel® modelo AGT-7/30, CA. USA), un resevorio-saturador de cosolvente de 150 mL, una celda de extracción de 40 mL, un separador de 50 mL, un controlador de temperatura (WATLOW serie SD 31, MI, USA, ± 1 °C) con termocupla tipo K conectada a una resistencia de 300 watts que rodea la celda de extracción y válvulas de paso (WHITEY series SS-1VS4 y SS-1VR4, OH, USA) y manómetros análogos (BOURDON HAENNI, Vendóme, Cedex, France, 700 bar). Dicho equipo permite hacer extracciones con CO2 supercrítico adicionado con cosolventes en modo estático.
Las extracciones con cada cosolvente se dividieron en dos grupos, extracciones de blanco de matriz (sin plaguicidas, realizadas para identificar posibles interferentes) y extracciones de muestras blanco de suelo fortificadas con los plaguicidas. En cada caso se emplearon porciones de 10 g de suelo previamente tamizado. Las muestras de suelo fueron fortificadas a las concentraciones indicadas en la Tabla 1 (concentración final de plaguicida en el suelo en mg/kg) empleando 512 µLdela mezcla de plaguicidas. Dicha fortificación se realizó dividiendo la muestra de suelo en 6 partes; en el centro de cada una se agregó, gota a gota, la mezcla de plaguicidas y posteriormente se homogeneizó con una espátula; una vez fortificada se dejó evaporar el solvente al aire durante 30 minutos.
Las condiciones de extracción empleadas para el blanco de matriz y muestras fortificadas fueron a 35 °C, 14 MPa (en modo estático). En cada extracción se empleó 10 mL de cada uno de los cosolventes (AcOEt, Me2CO y MeOH), los cuales fueron ubicados en el reservorio-saturador. El CO2 fue burbujeado a través de cada cosolvente con el fin de saturarlo previo a su paso hacia la celda de extracción. Cada muestra fue sometida a cuatro etapas de extracción cada una de quince minutos para un total de una hora de extracción; en cada etapa se recolectó el extracto obtenido, y finalmente se unieron para obtener el extracto final; este se almacenó a -20 oChastasu posterior análisis. El número de réplicas de extracción fueron dos para los blancos de matriz y tres para las muestras fortificadas.
Análisis de extractos
Los extractos obtenidos se concentraron a sequedad, cada uno por separado, se reconstituyeron en AcOEt y se analizaron en un cromatógrafo de gases HP6890 plus, equipado con un inyector automático 7683 Agilent Technologies (Palo Alto, CA., USA) y con control electrónico de presión, dotado con un inyector (división/sin división) conectado a un divisor de flujo (Y) de borosilicato acoplado a una columna capilar HP-5 (30 m, 0,32 mm d.i., 0,25 µm), acoplada a un detector de microcaptura electrónica ,µ-ECD63 Ni y con una columna capilar HP-50 (30 m, 0,32 mm d.i., 0,25 µm), acoplada en paralelo a un detector de nitrógeno-fosforo NPD. Las condiciones cromatográficas empleadas en el análisis de los plaguicidas fueron las siguientes: volumen de inyección 2 ,µL en modo sin división, con un pulso de presión de 65 psi durante 0,8 min; tiempo de purga de 0,6 min, flujo de purga 40 mL min-1 y temperatura de inyector de 256 °C. El gas portador fue nitrógeno. El programa de temperatura en el horno fue de 52 °C (0 min), a 100 °C, a una velocidad de 4 °C min-1; posteriormente la temperatura se incrementó hasta 110°Ca2°C min-1; a continuación se llevó hasta 130 °C, a una velocidad de 20 °Cmin-1, luego hasta 195 °Ca4 °Cmin-1 y finalmente se llegó a 280 °C a una velocidad de 5 °C min-1. El tiempo total del análisis fue de 64,25 min. La temperatura del detector ,µ-ECD fue 310 °C, con un flujo de gas auxiliar de 10 mL min-1 (N2). El detector NPD se trabajó a 330 °C con flujos de gas auxiliar de 10 mL min-1,H2 de3mLmin-1 y aire de 60 mL min-1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la selectividad y especificidad de la metodología
En las Figuras 2a y 2c se muestran los resultados obtenidos al analizar el extracto del blanco de matriz utilizando MeOH como cosolvente. Es evidente que para ninguno de los detectores empleados se obtuvieron señales significativas de los plaguicidas objeto de estudio, por lo cual se puede afirmar que el método utilizado es específico. Por otra parte, en las Figuras 2b y 2d se encuentran los cromatogramas de una muestra fortificada a las concentraciones indicadas en la Tabla 1 y extraída con MeOH como cosolvente. Para evaluar la selectividad del método se determinó la resolución entre las señales cromatográficas obtenidas para cada plaguicida, encontrándose valores cercanos o superiores a 1,5; de otra parte, se comprobó que las impurezas de la matriz no interfieren con los analitos de interés. Por tanto, se puede concluir que el método de análisis resultó ser adecuado para realizar los estudios de recuperación con el uso de AcOEt, Me2CO y MeOH como cosolventes.
Influencia de los cosolventes en la extracción
La evaluación de los resultados de cada uno de los cosolventes se realizó determinando los porcentajes de recuperación para cada uno de los plaguicidas bajo ensayo. La Figura 3a presenta un gráfico comparativo de los resultados encontrados con Me2CO y MeOH. En esta figura se puede observar que ciertos compuestos como heptenofos, acefato, metamidofos, triflumuron y monocrotofos no fueron extraídos con Me2CO, mientras que con MeOH se obtuvieron recuperaciones superiores al 70%; este hecho puede atribuirse a la mayor afinidad que tiene el MeOH con estas sustancias, pues cada una de ellas se caracteriza por presentar polaridades relativamente altas. Por otro lado, estos resultados concuerdan con diferentes estudios en los que se emplea MeOH en el proceso de extracción de moléculas de alta polaridad (12, 15).
En la Figura 3a también se aprecia que compuestos como dimetoato, metalaxil, fenamifos, tebuconazol y difenoconazol presentan recuperaciones mayores al usar MeOH con respecto a Me2CO; esto pone en evidencia que el empleo de MeOH como cosolvente mejoró la eficiencia en la extracción. Este incremento en la tasa de recuperación se puede atribuir principalmente a la interacción que tuvo cada plaguicida con el solvente, pues como se observa, los compuestos que presentan estructuras similares, como el difenoconazol y el tebuconazol, manifestaron mejoras en sus porcentajes de recuperación en la misma proporción (12).
Por otro lado, en la Figura 3a se observa que los porcentajes de recuperación obtenidos para los plaguicidas piretroides y organoclorados son muy similares empleando los dos cosolventes, e inclusive la dispersión de los resultados se encuentra dentro del mismo rango, a excepción de permetrina y cipermetrina. Además se ve que con metanol como cosolvente, los promedios de los porcentajes de recuperación son mayores en todos los casos, y este es un hecho que indica que la eficiencia en la extracción no sólo es función de la polaridad de las moléculas sino también de muchos otros factores (12).
En la Figura 3b, se encuentran los porcentajes de recuperación de los plaguicidas restantes, y se puede observar que en general los resultados hallados son similares para MeOH y Me2CO. Por otra parte, en las Figuras 3a y 3b se evidencia que al emplear MeOH se presentan los mayores porcentajes de recuperación con los coeficientes de variación más bajos (barras de error), para todos los plaguicidas hecho que reafirma que este cosolvente ofrece los mejores resultados en el proceso de extracción.
En cuanto a los resultados establecidos al usar AcOEt como cosolvente, se encontró que de los 32 plaguicidas analizados, 19 presentaron porcentajes de recuperación inferiores al 40%, mientras que los compuestos restantes arrojaron coeficientes de variación superiores al 30%. A partir de estos hechos se concluye que el empleo del AcOEt como cosolvente no resulta conveniente en las condiciones de trabajo empleadas para el presente estudio. La baja eficiencia en la extracción de plaguicidas encontrada con AcOEt se puede atribuir a diferentes factores como (i) baja polaridad en comparación a los demás cosolventes, lo cual limita la interacción que pueda tener la fase extractante con los analitos; (ii) presencia de una baja cantidad de AcOEt en el fluido su-percrítico o un bajo grado de saturación, que puede ocasionar un enmascaramiento del efecto modificador, y (iii) una mezcla no adecuada entre el AcOEt y el CO2 para la extracción de estos plaguicidas (16).
Finalmente, los resultados mostraron que a medida que la polaridad del solvente orgánico se incrementa (MeOH > Me2CO > AcOET), los porcentajes de recuperación de los plaguicidas aumentan y la dispersión de los resultados disminuye.
CONCLUSIONES
De los cosolventes empleados, el acetato de etilo mostró los porcentajes de recuperación más bajos para los plaguicidas en estudio, lo cual hace que el empleo de este cosolvente en las condiciones de trabajo del presente estudio resulte ser poco adecuado. Por otro lado, al emplear acetona como cosolvente se halló que cerca del 65% de los plaguicidas presentan un porcentaje de recuperación superior al 60%, y el mayor coeficiente de variación correspondió al 34,82%.
Al emplear metanol, se encontró que solo clorotalonil y diclofluanid presentaron porcentajes de recuperación inferiores al 60%, y los coeficientes de variación hallados resultaron ser los más bajos de los tres cosolventes empleados. En consecuencia, el empleo de metanol como cosolvente es la mejor alternativa para la extracción de los plaguicidas del presente estudio en suelo.
AGRADECIMIENTOS
Expresamos nuestro agradecimiento al Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, al Laboratorio de Alta Presión perteneciente al grupo de investigación Estudio de Cambios Químicos y Bioquímicos de Alimentos Frescos y Procesados, del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia.
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